商品屬性：

該試劑盒是在 TRIzol LS 的基礎上改造而成，主要成分為 TRIzol LS 試劑。利用 TRIzol LS 中的高序鹽成分，可使 RNA 結合于硅膠膜上，通過漂洗、洗脫即可獲得高純度RNA。該試劑盒專門用于血液、血漿/血清、病毒液等液體樣品，可在最短的時間內獲得高純度的 RNA。獲得的總 RNA純度高，沒有 DNA 和蛋白質污染，適用于 RT-PCR、qRT-PCR、芯片分析、Northern Blot 等實驗。藍圖
(1) Washing Buffer（已含乙醇）勿需加無水乙醇，請直接使用。
(2) TRIzol LS 含有強變性劑，請勿直接于皮膚接觸或吞咽，若接觸到皮膚或眼睛請盡快到醫院處理。實驗時務必穿實驗服，戴手套。
儲存：2-8℃避光保存，可保存 2 年。

操作方法
1.取 250 μl 抗凝全血、血漿、血清、病毒液樣本（體積不足時，加水至 250 μl），加入至 750 μl TRIzol LS 試劑中，然后立即手腕用力上下顛倒混合均勻，靜置 5min；如樣本為糞便等固體樣品，可用 PBS 重懸樣品，并勻漿后，3000 rpm離心 5min，取上清作為病毒液樣品，操作同上。
2. 向上述溶液中加入 0.2 ml 氯仿，手腕用力振蕩 15s，室溫放置 2min。
3. 13000rpm 離心 5min，準確吸取 0.5 ml（吸入過多或過少均影響回收率）無色上清至新的 1.5 ml EP 管中。
4. 向上述 0.5 ml 上清液中加入 0.3ml 異丙醇，手腕輕柔上下顛倒數次，并倒入吸附柱中，13000rpm 離心 15s。
5. 向吸附柱中加入 500 μl Washing Buffer，13000rpm 離心15s；重復此步驟一次。
6. 將吸附柱重新放回離心機，13000rpm 空離心 2min，將殘留的乙醇甩干。
7. 將吸附柱芯放入到 1.5 ml Nuclease Free 收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置 2min,13000rpm 離心 1min，洗脫液即為 RNA 產物，冷凍保存。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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